Teaching an old drug new tricks: re-profiling of nevirapine as an hdl modulator
Aline T. Marinho · Portuguese National Funding Agency for Science, Research and Technology (RCAAP Project by FCT) · 2018
Nevirapina (NVP), um inibidor da transcriptase reversa não-nucleósido (ITRNN) de 1ª geração, tem sido utilizado no tratamento da infeção pelo VIH-1 por mais de 20 anos. Este fármaco é um dos antirretrovirais mais prescritos a nível mundial devido à sua eficácia, baixo custo e perfil lipídico favorável, particularmente em relação aos aumentos dos níveis de colesterol das lipoproteínas de alta densidade (HDL). De facto, o tratamento antirretroviral com NVP tem sido associado à redução de lesões ateroscleróticas em doentes infectados pelo VIH. É importante salientar que não existem fármacos comercialmente disponíveis que permitam um aumento efectivo dos níveis de colesterol das HDL ou uma melhoria da funcionalidade das partículas de HDL. Apesar das vantagens clínicas associadas à NVP, este fármaco tem sido também associado à reações hepatotóxicas e de sensibilidade cutânea potencialmente graves, que impedem a sua indicação em outras áreas terapêuticas. Contudo, desenvolvimentos recentes na nossa compreensão da toxicocinética da NVP elucidaram que estas reações adversas estão relacionadas com vias de biotransformação e bioactivação específicas. A nossa hipótese, que se encontra fortemente embasada na literatura, é que o perfil benéfico da NVP na modulação das HDL é devido a um metabolito da NVP e não ao fármaco. De forma a testar esta hipótese, o principal objectivo do trabalho de investigação foi compreender as relações entre o tratamento com NVP, a biotransformação do fármaco e a modulação da funcionalidade das HDL, de modo a gerar conhecimento útil que permita o desenho racional de um novo fármaco modulador das HDL, com um melhor perfil toxicológico que a NVP. Este trabalho encontra-se focado em dois componentes do proteoma das HDL essenciais à funcionalidade destas partículas: Apolipoproteína A1 (ApoA1), o precursor e principal componente proteico das HDL, e a enzima antioxidante paraoxonase-1 (PON-1). Primeiramente, a nossa abordagem experimental baseou-se em dois estudos clínicos exploratórios conduzidos com doentes infectados pelo VIH, com um desenho prospectivo e transversal, respectivamente (Capítulo 1). Onze doentes infectados pelo VIH a iniciar terapêutica com NVP foram acompanhados prospectivamente por um período de até 20 semanas. No estudo transversal, foram incluídos um total de 146 doentes naïve e 186 doentes tratados com NVP (400 mg NVP/dia durante pelo menos 3 meses). Os end-points avaliados nestes estudos clínicos foram os níveis de colesterol das HDL, ApoA1, anticorpos anti-HDL e anti-ApoA1, atividades paraoxonase (POase), arilesterase (AREase) e lactonase (LACase) da enzima PON-1. O tratamento com NVP foi associado a níveis mais elevados de colesterol das HDL e ApoA1, maiores atividades da PON-1 e níveis mais reduzidos de anticorpos anti-HDL e anti-ApoA1, o que sugere uma melhor funcionalidade das HDL entre os doentes tratados com NVP. A modulação temporal da funcionalidade das HDL ao longo do tratamento com NVP evidenciou-se no estudo prospectivo. O evento observado mais precocemente foi o decréscimo dos anticorpos anti-HDL, enquanto que mudanças nos restantes end-points foram observadas mais tardiamente. No estudo transversal, mulheres tratadas com NVP constituíram o grupo de doentes com níveis mais elevados de colesterol das HDL e ApoA1. A análise das relações entre as concentrações plasmáticas de NVP e dos seus três principais metabolitos de fase I revelou que concentrações mais elevadas de NVP estão associadas a níveis mais elevados de 2-hidroxi-NVP (2-OH-NVP), 12-hidroxi-NVP (12-OH-NVP) e particularmente a níveis mais elevados de 3-hidroxi-NVP (3-OH-NVP). Este padrão de metabolitos poderá reflectir uma indução preferencial do CYP2B6 pela NVP, o que levaria à formação de 3-OH-NVP. Adicionalmente, proporções mais elevadas de 3-OH-NVP foram associadas a menores proporções de 2-OH-NVP e 12-OH-NVP. A proporção de 2-OH-NVP foi também fortemente associada a níveis mais baixos de anticorpos anti-HDL. Estas observações parecem consistentes com a activação do receptor constitutivo de androstano (CAR) pela NVP, enquanto que o efeito tardio na modulação da funcionalidade das HDL sugere a acumulação de um metabolito da NVP com perfil lipídico mais favorável. De modo a esclarecer a contribuição individual de cada via de biotransformação da NVP na modulação da PON-1 e da ApoA1, foram realizados estudos in vitro com três modelos de hepatócitos. A NVP e os seus principais metabolitos de fase I, 2-OH-NVP e 12-OH-NVP, foram incubados em culturas primárias 2D e 3D de hepatócitos de rato e também em culturas 2D da linha celular HepG2. Comprovou-se que o modelo 3D de hepatócitos é o mais adequado para investigar os efeitos da NVP e dos seus metabolitos na PON-1 (Capítulo 2) e na ApoA1 (Capítulo 3). O metabolito 12-OH-NVP promoveu um aumento das três actividades da PON-1, após um período de exposição de apenas 4 dias. Por outro lado, os aumentos dos níveis de ApoA1 ocorreram após 12 dias de exposição: a NVP induziu um aumento de 43 % enquanto o 2-OH-NVP induziu um aumento de 86 %. Estas evidências in vitro sugerem que a formação de 12-OH-NVP parece ser o principal factor responsável pelo aumento das actividades da PON-1 induzido pela NVP, enquanto que os efeitos tardios do 2-OH-NVP apontam para um efeito na ApoA1 devido a geração e a acumulação de um metabolito de fase II. Estas descobertas preliminares são particularmente relevantes considerando a importância da PON-1 e da ApoA1 como alvos terapêuticos. Por exemplo, a PON-1 tem sido implicada na patogénese de diversas doenças relacionadas com o envelhecimento. Relativamente à ApoA1, o aumento desta proteína anti-aterogénica tem sido considerado com uma das abordagens mais promissoras com vista ao aumento dos níveis de colesterol das HDL e para melhoria da função das HDL. Para além da área cardiovascular, níveis reduzidos de ApoA1 têm sido descritos em muitos tipos de neoplasias. Adicionalmente, considerando o perfil dimórfico dependente do sexo associado à modulação da ApoA1 induzida pela NVP, observado no estudo clínico transversal, foi formulada a hipótese de que a NVP ou um análogo pudessem ter uma aplicação terapêutica em neoplasias que afectam particularmente as mulheres. Esta suposição levou-nos ao cancro do ovário, uma neoplasia especificamente feminina e com mau prognóstico, caracterizada por uma expressão de ApoA1 diminuída no tecido ovárico e por níveis reduzidos de ApoA1 no plasma. Por esta razão, foram investigados os efeitos da ApoA1 e de um péptido mimético da ApoA1 no fenótipo maligno de células de cancro do ovário (Capítulo 4). A ApoA1 e o péptido 4F foram ambos capazes de reduzir a viabilidade de linhas celulares de cancro do ovário. A ApoA1 reduziu a capacidade de invasão das células SKOV3, enquanto que o péptido mimético da ApoA1 provocou a supressão da via de sinalização do Akt. De acordo com este efeito na via do Akt, o péptido mimético da ApoA1 tornou as células de cancro do ovário mais sensíveis à cisplatina. Este efeito foi observado não só in vitro mas também no ensaio in ovo em membrana corioalantóica (CAM), um modelo mais relevante do ponto de vista biológico. Estes resultados corroboram o efeito anti-tumorigénico da ApoA1 e do péptido mimético da ApoA1. Em conclusão, com este trabalho de investigação foi possível contribuir para uma melhor compreensão do papel da biotransformação da NVP na modulação da funcionalidade das partículas de HDL. Esta abordagem inovadora, guiada pelo conhecimento das vias de biotransformação da NVP, poderá contribuir para o desenvolvimento de novos fármacos cujo alvo terapêutico seja a HDL. Tais fármacos podem ajudar a ampliar os recursos terapêuticos para diversas patologias que estão relacionadas com uma baixa funcionalidade das HDL, da aterosclerose às neoplasias.